Uma análise quantitativa de vários padrões aplicados em microscopia de folha de luz reticulada

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 4607 (2022) Citar este artigo

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Os microscópios de folha de luz reduzem a fototoxicidade e o fundo e melhoram a velocidade da imagem em comparação com os microscópios de campo amplo e confocal. No entanto, quando equipado com feixes gaussianos, o poder de resolução axial de um microscópio de lâmina de luz e o campo de visão observável estão inversamente relacionados. Folhas de luz baseadas em redes ópticas pontilhadas melhoram a resolução axial e a uniformidade do feixe em comparação com os feixes gaussianos usando padrões de iluminação estruturados axialmente. No entanto, essas vantagens vêm à custa de uma iluminação total aumentada para o espécime e uma diminuição do confinamento axial do padrão de iluminação. Usando simulações e medições experimentais em células fixas e vivas, quantificamos as diferenças entre folhas de luz gaussianas e de rede na uniformidade do feixe, resolução axial, resolução lateral e fotobranqueamento. Demonstramos como diferentes padrões de iluminação de rede óptica podem ser ajustados para priorizar a resolução axial ou o corte óptico. Finalmente, introduzimos uma abordagem para fundir espectralmente aquisições sequenciais de diferentes padrões de folha de luz de rede com propriedades ópticas complementares para obter imagens de alta resolução e baixo fundo.

Nas últimas duas décadas, a microscopia de folha de luz tem sido usada para obter imagens de amostras biológicas de várias escalas, variando de moléculas individuais a organismos inteiros1,2,3,4. A microscopia de folha de luz ilumina apenas um plano fino no espécime. Isso minimiza a iluminação fora de foco, reduz o fotobranqueamento e aumenta a relação sinal-ruído (SNR) em comparação com a epifluorescência e a microscopia confocal. Além disso, na microscopia de fluorescência, a função de espalhamento de ponto geral (PSF) é um produto de PSFs de excitação e detecção. Assim, se o padrão de iluminação for comparável ou mais fino que a profundidade de campo de detecção, a iluminação de plano único também pode melhorar a resolução axial. Embora os métodos de varredura de pontos, como o confocal, também aumentem a resolução axial e o corte óptico, a iluminação plana com detecção de campo amplo permite velocidade de imagem 100 a 1.000 vezes mais rápida com fotobranqueamento dramaticamente menor5.

As implementações mais comuns de microscopia de folha de luz usam lentes cilíndricas para focalizar um feixe gaussiano em uma folha estendida lateralmente com um perfil de intensidade axial gaussiano na amostra. Essa abordagem resulta em uma compensação inerente entre a espessura da folha de luz e seu comprimento de propagação. Folhas de luz gaussianas mais finas fornecem maior resolução axial e seccionamento óptico, mas ao custo de um menor comprimento de propagação e menor campo de visão. Em contraste, folhas de luz gaussianas mais espessas podem gerar imagens de áreas maiores, mas têm resolução e seccionamento óptico mais baixos. Para superar essas compensações, vários grupos propuseram o uso de folhas de luz estruturadas para iluminação, incluindo feixes Bessel6,7, feixes arejados8,9 e redes ópticas2,10 para desacoplar a resolução axial do comprimento de propagação do feixe. Na prática, tais feixes idealizados, sem difração, exigiriam energia infinita e não poderiam ser realizados fisicamente. Em vez disso, o que são gerados são feixes que são híbridos de feixes gaussianos e não difrativos (por exemplo, Bessel-Gauss ou treliça-Gauss) em que o padrão de iluminação é limitado por um envelope de atenuação distribuído axialmente para confinar a energia de iluminação em torno de um único plano em o espécime. Variando a largura do envelope de atenuação na amostra ou equivalentemente, espalhando a distribuição de intensidade da iluminação no plano focal traseiro da objetiva de excitação ao longo de kz (que também é a direção axial da objetiva de detecção) permite ao usuário ajustar o caractere do padrão de iluminação para favorecer o comprimento de propagação, resolução axial ou seccionamento óptico, dependendo da amostra biológica e dos objetivos de imagem.